[단백질] 단백질 연구 시 고려해야 할 사항 1편_완충용액 (Buffers)
단백질은 세포의 구성 요소일 뿐 아니라
거의 모든 세포기능을 실행하는 물질입니다.
단백질이 여러 다양한 기능을 수행하는 것은
단백질이 수없이 다른 3차원 모양을
형성하기 때문입니다.
때문에,
각 기능은 단백질의 구조에 의해 좌우됩니다.
단백질에 대한 첫 단계는
대부분 세포 내에 존재하고 있는 단백질을
조절 가능할 수 있도록 파쇄하는 것이고,
이는, 단백질이 세포 내에 존재하고 있던 환경과는
전혀 다른 환경에 노출되기 때문에
이에 대한 조절은 반드시 필요합니다.
1. 완충용액이란?
완충용액은 약산과 그 짝염기의 혼합물로,
소량의 산(H+), 염기(OH-)가 첨가되었을 때
그 용액의 급격한 pH 변동을 억제하는 용액입니다.
이러한 원리로
완충용액은 세포와 조직에
pH 변동에 저항함으로써
세포와 조직에 완충작용을 합니다.
2. 완충액 (Buffer)의 pH
용액의 pH를 유지하기 위하여
완충액을 사용하게 됩니다.
각 완충액마다 적정 pH를 가지고 있고,
이 pH range에서 사용하여야
완충 능력을 가지게 됩니다.
각 buffer 별 pH range는 다음과 같습니다.
또한, 실험의 편의상 실험실에서는 보통
10~100 배 농축된 완충액을 만들거나 사서
희석시켜 사용하는데
희석에 따라 pH가 변화하기 때문에
사용할 때마다 보정을 할 필요가 있습니다.
예를 들어,
인산완충액 0.1 M, pH 6.7을
10 배 희석 시 → pH 6.8
100 배 희석 시 → pH 7.0이 됩니다.
Tris는 10 배 희석할 때마다
pH가 0.1 씩 내려갑니다.
3. 완충액(Buffer)의 오염 방지
완충액은 미생물의 번식이 용이합니다.
따라서,
오염을 방지하기 위해
1. 여과하거나
2. 냉장 보관하거나
3. 0.02 % (=3 mM) sodium azide를 첨가
하기도 합니다.
4. 완충액(Buffer)의 농도
완충액을 사용할 때에는
가장 낮은 농도를 사용하는 것이 좋습니다.
결국, 완충용액도 ionic,
짝산-짝염기 원리를 이용한 것이기 때문에
비특이적 ionic strength의 효과를
방지하는 것이
실험할 때 유리하게 됩니다.
5. 완충액(Buffer) 별 특성 및 한계
1. 인산완충액
한계:
다가 양이온과 결합력이 큽니다.
다가 양이온과 결합하게 되면
완충용액의 완충력이 저하되고,
여러 효소가 활성을 잃습니다.
(kinase, phosphatase 등)
2. MOPS
한계:
Lowry에 의한 단백질 정량 시 분석을 방해합니다.
3. HEPES
한계:
Lowry에 의한 단백질 정량 시 분석을 방해하고,
piperazine를 함유한 다른 완충액과 같이
free radical을 쉽게 생산합니다.
산화/환원 반응 연구에는 적합하지 않습니다.
4. Tris
한계:
세포막을 쉽게 통과하고,
금속 이온과 결합하여 proton을 분비하고,
pH를 낮추며 불용성 침전을 만듭니다.