[qPCR] Quantitative Real-time PCR_형광 표식 probe 비교

qPCR 형광표식 비

 

Quantative real-time PCR이란?
: 각 유전자의 정확한 정량을 위해 실시간으로 형광을 측정하여 분석하는 PCR 기법

 

형광표식 probe는 크게 3가지로 나눌 수 있는데, 일반적으로 SYBR Green을 가장 많이 사용합니다.
1. DNA binding agents: SYBR GreenⅠ
2. Hydrolysis probe: TaqMan probe & Beacons & Scorpions
3. Hybridization probe: Light Cycler
 
그중에서도 가장 많이 사용하는 SYBR Green Ⅰ과 TaqMan을 비교하는 그림을 보며 이해해 봅니다.

가장 많이 이용하는 SYBR GreenⅠ vs TaqMan probe 비교

 

1. DNA binding agents: SYBR GreenⅠ

- Double strand DNA(dsDNA)에 결합하여 형광을 나타내는 시약 (interchelator)입니다.
- Interchelator는 PCR 반응으로 합성된 dsDNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭 산물의 양을 측정할 수 있습니다.
 

2. Hydrolysis probe: TaqMan probe & Beacons & Scorpions

- Reporter와 quencher가 인접하여 제작된 probe는 repoter의 fluorescence를 quencher가 흡수합니다. 
- DNA polymerase(예, Taq polymerase)의 endonuclease 기능에 의해 TaqMan probe로부터 flurophore가 reporter와 분리되어 reporter에 의해 fluorescence가 발합니다.
 
* TaqMan probe 법
: 5' 말단은 형광물질 (FAM 등)로 3' 말단은 quencher(TAMRA 등)으로 수식한 oligonucleotide (TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법
 
 
그 외에는 Hybridization 방법이 있습니다. 
Hybridization 방법의 원리와 Hydrolysis probe와의 비교를 나타내는 그림을 볼까요?
 
 

Hybridization probe 방법

Hybridization vs Hydrolysis probe 비교

 
3. Hybridization probe: Light Cycler

- Probe를 두 개를 디자인하여 한쪽에는 Acceptor dye (5'), 다른 한쪽에는 Donor dye (3')를 붙여서 annealing 단계에서 detection 됩니다. 
 
 

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SYBR Green Ⅰ vs TaqMan probe 비교
 
 

가장 많이 사용하는 두 probe를 비교하자면 다음과 같으며, 
실험을 진행하고자 하는 계획이나 목적에 맞게 probe를 선택하면 됩니다.
 

	SYBR GreenⅠ	TaqMan probe
template DNA specificity	dsDNA에 비특이적으로 결합함.	template DNA에 특이적으로 hybridize하면서 형광을 나타내기 때문에 더 specificity함. One target specificity
번거로움	따로 설계하는 번거로움이 적음.	Probe design을 해야 하는 번거로움이 있음.
가격	비교적 저렴함. (더 저렴한 Eva Green이 존재함.)	상대적으로 비쌈.

 

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[Reference]
1. 다윈바이오
: http://www.dynebio.co.kr/yc/bbs/board.php?bo_table=data1&wr_id=26
2. 구글
: https://www.researchgate.net/publication/260248152_Real-Time_PCR_for_Gene_Expression_Analysis