[Cell] Cell counting 하는 법

Cell counitng 방법

 

Cell을 Counting 하는 방법에 대해 알아보겠습니다.

 

Cell counting이란 말 그대로, 세포의 수를 세는 과정입니다. 

실험 시, 실험에 사용하는 cell의 수를 동일하게 함으로써 실험을 통제하기 위한 방법으로 사용합니다.

 

이 중, 현미경으로 직접 개수를 세는 방법에 대해 알아보겠습니다.

 

 

1. Hemocytometer 준비

1. 70 % EtOH을 이용하여 Hemocytometer를 깨끗하게 씻습니다.
2. Hemocytometer kit에 제공되는 Coverslip을 촉촉하게 적신 후, Hemocytometer 위에 조심히 올립니다. 이때, coverslip이 잘 깨지기 때문에 주의하여 조심합니다.

   

   Hemocytometer

2. Cell 준비

1. Cell을 resuspension한 후, 10 μL를 1.5 mL tube에 옮겨 담습니다.
2. 10 μL trypan blue를 cell suspension 용액과 충분히 섞어줍니다.

3. Cell counting

1. 10 μL 세포 현탁액을 피펫으로 hemocytometer 홈에 주입합니다.
2. Microscope으로 초점을 맞추고, 세포 수를 셉니다. (세포 수를 세는 방법은 실험에 따라 차이가 있을 수 있습니다.)
   • Trypan blue에 염색이 되어 파란색으로 변한 cell은 죽은 세포 이기 때문에 counting 하지 않습니다.
   • 규칙을 정해야 합니다. 네 변 중 두 변 (위, 왼쪽)만 counting 하면, 그 외 두 변 (아래, 오른쪽)은 counting 하지 않습니다.

     

     cell counting

3. 계산식: Cell density (mL) = Total cell count / Number of square x Trypan blue dilution factor x 10^4
   • 예를 들어, 아래의 핑크색 부분만 counting하였다면, 
   • 100 (total cell count) / 4 (number of square) x 2 (trypan blue dilution factor) x 10^4 = 5 x 10^5 cells/mL
   • Total cell number = Cell density x Cell suspension volume (mL)
   • 예) 5 x 10^5 cell /mL x 2 (mL) = 1 x 10^6 Total cells 

     

 

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Q. Cell counting 시 10^4 을 하는 이유는?

 

cell counting

Cell counting은 여기에 보이는 9개의 칸 중 1개를 평균으로 counting을 하는 방법입니다.

 

즉, 1칸의 volume에 있는 cell을 기준으로 계산을 하는 것이라는 뜻입니다.

 

1칸의 volume = 가로 (1 mm) x 세로 (1 mm) x 높이 (0.1 mm)

1칸의 volume = 가로 (1 x 10^-1 cm) x 세로 ( 1 x 10^-1 cm ) x 높이 ( 1 x 10^-2 cm) = 1 x 10^-4 cm^3 (mL=cm^-3)

 

따라서, 1 mL에 들어있는 cell 수를 아릭 위해서는 sample 1 mm^3 칸에 든 평균 cell 수에 희석 배율과 10^4를 해주면 cell 수를 얻을 수 있습니다.